Lasermikroskopie

Lasermikroskopie, besonderes Verfahren der Mikroskopie, bei der ein fokussierter Laserstrahl zum Einsatz kommt.

Im Gegensatz zur konventionellen Weitfeld-Lichtmikroskopie bedient sich die Lasermikroskopie, auch konfokale Laser-Raster-Mikroskopie genannt, eines scharf gebündelten Laserstrahls (Gas-, Feststoff- oder Diodenlaser), um das zu untersuchende Präparat Punkt für Punkt und Zeile für Zeile abzurastern, und einer sehr feinen Lochblende in der Zwischenbildebene, um parafokale Lichtstrahlen vom Detektor (CCD-Chip oder Photomultiplyer) fern zu halten. Das Bild wird nach digitaler Aufbereitung der Messdaten auf einem Computermonitor entworfen und steht damit auch einer weiteren EDV zur Verfügung. Lasermikroskope funktionieren im Auflichtbetrieb und werden in der Regel zur Darstellung fluoreszenzmarkierter Präparate verwendet. Vorteilhaft ist neben der spektralen Schmalbandigkeit des Laserlichts und der hohen erreichbaren räumlichen Auflösung die Möglichkeit, nahezu verletzungsfrei optische Schnitte durch lebende Zellen zu führen und danach drei- bis vierdimensional zu rekonstruieren („life cell imaging“).

Besonders trickreich ist in der Lasermikroskopie die so genannte 2-Photonen-Anregung: während die Anregungsenergie einzelner Lichtquanten für optische Fluoreszenz höher sein muss als die der emittierten Quanten und damit von kürzerer Wellenlänge (Stokes-Verschiebung), kann durch gleichzeitige Anregung eines Farbstoffmoleküls mit zwei Photonen halber Energie und damit doppelter Wellenlänge der gleiche Effekt erzielt werden. Praktisch wird das durch den Einsatz Femtosekunden-gepulster Infrarotlaser erreicht. Derartige Lasereinkoppelungen ermöglichen vergleichsweise große Eindringtiefen (die Streuung sinkt proportional zur vierten Potenz der Wellenlänge) und minimale Lichtschäden wegen der geringen Quantenenergie. Zudem wird die räumliche Auflösung drastisch verbessert, da eine endliche Wahrscheinlichkeit zur 2-Photonen-Anregung nur im Fokus besteht und damit im Präparat keine parafokalen Leuchtkegel entstehen.

Gezielte Mehrfachmarkierung oder die Verwendung von Calcium- oder pH-abhängigen Farbstoffen, zusammen mit dem Einsatz verschiedener Anregungslinien und Filterkombinationen, ermöglichen die detaillierte Analyse der Struktur und Dynamik von Zellen. Besonders bei Echtzeit-Anwendungen an Lebendpräparaten werden hier große Anforderungen an die Datenübertragungsraten und die digitale Bildverarbeitung gestellt. Die aktuellen Bemühungen in der Entwicklung der Lasermikroskopie richten sich dabei u. a. auf eine Optimierung der räumlichen Auflösung (z. B. 4-Pi-Mikroskopie), adaptive Minimierung der Photonendosis, Verbesserung der spektralen Trennschärfe für Vielfarbenmarkierungen oder intelligente Abtastroutinen zur schnellen automatischen Objekterkennung und -verfolgung. Zeitlich hochauflösende Verfahren der Lasermikroskopie analysieren die vom chemischen Mikromilieu des Fokuspunktes abhängige Fluoreszenzabklingzeit oder die Emissionsraten zweier interagierender Molekülsorten (Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Mikroskopie).

Stark gebündelte, intensive Laserstrahlen kommen in der Mikroskopie aber nicht nur zum Zweck der Abbildung zum Einsatz, sondern auch zur berührungslosen Mikromanipulation von Zellen und Zellbestandteilen im Sinne einer Laserpinzette.

Siehe auch Mikroskop; Optik